ПОТРЕБЛЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА МИКРООРГАНИЗМАМИ В ПРЕСНЫХ ВОДОЕМАХ

Материалы доклада на заседании секции гидробиологии и ихтиологии МОИП

Введение

Через клеточную стенку микроорганизмов проникают лишь низкомолекулярные соединения. Поэтому высокомолекулярные соединения должны быть предварительно гидролизованы экзоферментами. В гетерогенных системах (почвах, илах, на поверхности детрита и др.) выделенные в среду ферменты локализованы в непосредственной близости от клетки, а продукты гидролиза сразу же потребляются этими организмами (Купревич, Щербаков, 1966; Хазиев, 1976). В толще воды (в гомогенной системе) ферменты, выделяются непосредственно в среду, а продукты гидролиза потребляются всей находящейся там биотой.

Потребление органического вещества бактериям и водорослями вызывает резонный вопрос о способности этих групп микроорганизмов выделять в среду экзоферменты и взаимосвязи этих процессов с их гетеротрофной активностью. Чтобы ответить на некоторые из этих вопросов, и был проведен ряд экспериментов с природным фито-и бактериопланктоном и лабораторными культурами водорослей и бактерий.

В работе анализировали потребление водорослями и бактериями низко- и высокомолекулярных соединений (на примере аминокислоты и белка) с одновременным анализом в среде протеолитической активности.

Исследования с природным сообществом фито-и бактериопланктона показали, что в воде присутствуют протеазы, которые гидролизуют белок до аминокислот. Последние в дальнейшем потребляются как водорослями, так и бактериями.

Ферментативные процессы протекают, как в присутствии природного сообщества фито- и бактериопланктона, одних только бактерий (после отфильтровывания водорослей) и так называемой «чистой» воде (т.е. после отфильтровывания бактерий).                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                

Способность «чистой» воды к ферментативному гидролизу белка указывает на наличие экзопротеаз в свободном состоянии. На долю этого фильтрата (т.е. «чистой» воды) приходилось две трети от ферментативной активности природного сообщества фито- и бактериопланктона. Показатели ферментативной активности воды с одними только бактериями практически совпадали с аналогичными показателями воды с фито- и бактериопланктоном. Пики гетеротрофной и ферментативной активности фито-и бактериопланктона  совпадали, что опять же подчеркивает взаимосвязь этих процессов.

Эспериментальная часть

Это показывает, что организмы выделяют в среду литические ферменты (в частности, протеазы), которые функционируют вне связи с организмами – их продуцентами. Это в дальнейшем позволяет потреблять продукты гидролиза всем комплексом присутствующих гидробионтов.

Аналогичное наблюдали в альгологически чистых культурах Scenedesmus quadricauda, Chlorella vulgaris, Spirulina sp. и бактерии Bacillus subtilis. На долю «чистой» культуральной жидкости B. subtilis приходилось около 70% протеолитической активности среды, в которой находились эти бактерии. У водорослей (Spirulina sp., S.quadricauda, Ch. vulgaris) аналогичные показатели составляли соответственно 94%, 75% и 50%. Наличие ферментов в свободном состоянии дает возможность утилизировать продукты гидролиза субстрата всеми присутствующими организмами, как бактериями, так и водорослями.

Так как в альгологически чистых культурах водорослей присутствовали бактерии, в этих опытах трудно установить источник продуцирования экзоферментов. Это могли быть, как бактерии, так и водоросли, тем более что результаты ферментативной активности водорослей совместно с бактериями было выше, чем одних только бактерий (после отфильтровывания водорослей). Складывается впечатление, что водоросли вносят свою долю экзоферментов в их общее количество. Однако если учесть, что при отфильтровывании водорослей возможно частичное удаление бактерий (особенно конгломератов, детритно-бактериальных ассоциаций), то, возможно, это и приводит к заниженным результатам  ферментативной активности бактерий.

Далее возникает вопрос, а выделяют ли экзоферменты сами водоросли? Эксперименты с аксеничными (безбактериальными) культурами Anabaena variabilis, Chlorella vulgaris, Scenedesmus quadricauda, Chlamydomonas gyrus показали, что эти водоросли и цианобактерии довольно хорошо потребляют меченую аминокислоту (¹⁴С-глутаминовую кислоту). Высокомолекулярное соединение – белок  (¹²⁵I-бычий сывороточный альбумин) – ими не включалось в клетки (Дмитровский, Садчиков, 1994). Кроме того,  ферментативная активность среды с водорослями в присутствии белка не обнаруживалась (при использовании метода поляризации флуоресценции). Некоторые водоросли культивировали три недели и в течение всего этого времени  фототрофы потребляли только меченую аминокислоту.  Потребление ими белка не происходило, а протеолитическая активность в среде не обнаруживалась.

В отличие от водорослей, Bacillus subtilis хорошо потреблял как меченые аминокислоты, так  и меченый белок. Протеолитическая активность в среде B.subtilis постоянно регистрировалась.

Известно, что экскреция в среду большинства литических ферментов происходит лишь при наличии в среде субстрата. В его отсутствии ферменты синтезируются с очень низкой скоростью, однако при появлении субстрата, скорость синтеза фермента резко возрастает. Образовавшиеся в процессе ферментативного гидролиза  продукты распада накапливаются в среде и потребляются гидробионтами. Повышение концентрации продуктов гидролиза выше определенного порога приводит к блокированию синтеза бактериями фермента, а, соответственно, и его экскреции в среду. Аналогичное происходит как внутри клетки, так и природных условиях (Дин, 1981; Квестинадзе, 1984; Прист, 1987). Таким образом, организмы  контролируют секрецию как внутриклеточных, так и некоторых внеклеточных ферментов.

Чтобы проследить это, перечисленные выше водоросли  культивировали в присутствии белка (альбумина). Показано, что  и в этом случае протеолитическая активность в бактериально чистых культурах не наблюдалась (по методу поляризации флуоресценции). Внесение белка в среду не влияло на потребление водорослями меченой по ¹⁴С-глутаминовой кислоты. Это еще раз указывает на отсутствие  протеолитической активности у перечисленных видов водорослей. Однако, при «заражении» культуры водорослей бактериями (что осуществили на 25 сутки культивирования Anabaena variabilis), в среде сразу же стала регистрироваться протеолитическая активность и цианобактерия начала потреблять белок.

Добавление фильтрата Bacillus subtilis в культуру бактериально чистых культур Anabaena variabilis и Scenedesmus quadricauda приводило к увеличению гетеротрофной активности этих водорослей: у S.quadricauda – она возрастала в 2 раза, а у A. variabilis – в 7 раз. В бактериальном фильтрате содержатся ферменты (протеазы), которые гидролизуют имеющийся в среде белок, что способствует повышению гетеротрофной активности водорослей (Садчиков, Френкель, 1993; Садчиков, Френкель, Дмитровский, Еремин, 1993; Садчиков Френкель Скобеева, 1992).

Все это указывает на неспособность водорослей экскретировать в среду протеазы, а возможно, и другие литические ферменты. Проведенные эксперименты показывают, что основная роль в ферментативном гидролизе органического вещества принадлежит бактериям. Водоросли потребляют низкомолекулярные продукты, которые были гидролизованы ферментами бактерий.

     Активность ферментов определяется различными методами. Как правило, присутствие ферментов обнаруживается по протеканию специфических реакций, а о его количестве судят по скорости реакции. Поэтому измерение скорости реакции является наиболее существенной частью в методике исследований ферментов. Скорость реакции определяется либо по скорости убывания исходного субстрата, либо по скорости образования продуктов реакции.  Количество многих органических веществ в водоемах недостаточно для прямого измерения, а их концентрирование – процесс трудоемкий и не всегда  эффективный. Все это значительно осложняет применение биохимических методов в гидробиологических исследованиях.

     Этих недостатков лишен метод, основанный на измерении поляризованной флуоресценции. Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет определять  экзопротеазную активность всего за несколько минут без всякого концентрирования пробы. С помощью этого метода можно получать информацию о размерах, конформации и внутренней подвижности молекул (Юденфренд, 1965). Он широко применяется при изучении кинетики ферментативных процессов, в фармакологии, биохимии и др. (Бекбергенов, Житников, 1988; Савицкий, 1990).

Общая схема проведения  экспериментов по изучению протеолитической активности относительно проста и имеет следующий вид. В анализируемую пробу добавляется трассер (меченый флуоресцентным красителем белок) и анализируется степень его деградации под воздействием присутствующих в воде ферментов.

Интенсивность броуновского движения молекул зависит, в частности, от их размера. Если молекула содержит флуоресцентную метку, то поляризация флуоресценции служит мерой броуновского движения и дает информацию о размерах макромолекул. Под действием ферментов происходит их гидролиз, а это, в свою очередь, сказывается на величине поляризации флуоресценции. Таким образом, по величине поляризации флуоресценции можно судить об относительном изменения размеров макромолекул в процессе ферментативной реакции.

В качестве метки используется флуоресцентный краситель – флуоресцеин. Последний при возбуждении испускает флуоресцентный свет, степень поляризации которого зависит от скорости его вращения. Метка в свободном состоянии вращается быстро; между периодом поглощения и испускания света молекула равновероятно принимает любую ориентацию, что приводит к полной деполяризации сигнала. Т.е. в водном растворе поляризация флуоресцеина приближается к нулю. Если же метка связана с крупными молекулами (в частности, с белками), то в течение периода флуоресценции его вращение  замедляется, и величина поляризации возрастает. Таким образом, чем крупнее молекула, тем выше величина поляризации. Под действием ферментов происходит гидролиз пептидных связей в молекуле белка, в результате чего размеры молекул уменьшаются и это сказывается на величине поляризации флуоресценции.

Выводы

Таким образом, несмотря на интенсивное потребление органического вещества (ОВ) водорослями,  гетеротрофная активность последних в значительной степени зависит от жизнедеятельности бактерий. Утилизация высокомолекулярных соединений водорослями осуществляется только в присутствии бактерий, поскольку сами водоросли не выделяют в среду экзоферменты (по крайней мере, в наших экспериментах), а потребляли уже готовые продукты гидролиза. Бактерии и продуцируемые ими литические экзоферменты «подключают» к процессу разрушения ОВ и других гидробионтов, потребляющих только низкомолекулярные соединения.

Литература

1.Бекбергенов Б.М., Житников В.Г. Иммуноанализ на основе прямого измерения поляризации флуоресценции при изучении фармакокинетики антибиотиков. // Антибиотики и химиотерапия. 1988, т. 33. № 1, с. 72-76.

2.Дин Р. Процессы распада в клетке. – М. Мир, 1981. – 120 с.

3.Дмитровский Л.Г., Садчиков А.П. Стимуляция протеолитической активности бактерий некоторыми водорослями. // Гидробиологический журнал, 1994, т. 30, № 1, с. 53-59. 

4.Квестинадзе  Г.И. Грибные и бактериальные амилазы. Тбилиси, Мецниереба. 1984. -154 с.

5.Купревич В.Ф., Щербакова Т.А. Почвенная энзимология. Минск, Наука и техника,  1966.  – 275 с.

6.Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. М. Мир, 1987. 187 с.

7.Савицкий А.П. Флуоресцентный анализ: иммуноанализ, гибридные ДНК, биосенсоры. // Успехи биологической химии, 1990, т. 31, с. 209-240.     8.Садчиков А.П., Френкель О.А., Скобеева  Т.Н. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий. // Гидробиологический журнал, 1992, т. 28, № 6, с. 51-55. 

9.Садчиков А.П., Френкель О.А., Дмитровский Л.Г.,  Еремин С.А. Ферментативная и гетеротрофная активность водорослей и бактерий при потреблении меченых аминокислот, дипептида и белков. // Гидробиологический журнал, 1993, т. 29, № 3, с. 71-76.

10.Садчиков А.П., Френкель О.А. Влияние концентрации белка на протеолитическую активность бактерий (на примере Bacillus subtilis). // Гидробиологический журнал, 1993, т. 29, № 4, с. 81-85.

11.Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. – М. Наука, 1976,  173 с.  

12.Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в химии и медицине. // М.: Мир,, 1965, 484 с.